WB實(shí)驗(yàn)指南

樣品制備：

變性條件——SDS Loading Buffer直接裂解：

用常溫或者高溫預(yù)熱過(guò)（預(yù)熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，LB久煮某些性質(zhì)會(huì)改變）的5×SDS LB按比例加到細(xì)胞或者組織上并煮樣。如果SDS LB不夠，樣品蛋白濃度過(guò)高時(shí)，煮樣后會(huì)發(fā)現(xiàn)吸不上來(lái)，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住槍頭。這時(shí)候常規(guī)做法有兩種，1. 再煮5min。常規(guī)煮樣時(shí)間3-5min，樣品過(guò)濃時(shí)就煮10min；2.如果10min煮樣后，仍然吸不起來(lái)，才適當(dāng)增加SDS LB，繼續(xù)煮。煮樣時(shí)間若過(guò)長(zhǎng)，蛋白會(huì)凝固，此時(shí)以失去繼續(xù)WB的意義，請(qǐng)丟棄（判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)明顯的蛋白沉淀和水分層）

此方法的缺點(diǎn)，SDS LB煮過(guò)的樣品如果用來(lái)做IP，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。

 

非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細(xì)胞器分離等等了，其實(shí)類(lèi)似）

裂解細(xì)胞請(qǐng)盡量冰上操作，減緩酶解作用。

使用溫和裂解液裂解（配方：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and 0.5mM PMSF）。

此方法的優(yōu)點(diǎn)：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細(xì)胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗(yàn)。其他Na鹽濃度的細(xì)胞裂解液也很常見(jiàn)，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細(xì)胞時(shí)染色體會(huì)析出，細(xì)胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗(yàn)，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強(qiáng)的復(fù)合體，要得到純化的一些復(fù)合體的組成蛋白一般采用極端的高鹽裂解細(xì)胞。

 

組織塊裂解：

組織塊較大用勻漿的方法最合適，現(xiàn)在有不少轉(zhuǎn)頭很小的勻漿器。

當(dāng)組織超微量的時(shí)候，比如50mg新鮮癌組織，我采用的方法是

1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。

2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進(jìn)一步破碎；反復(fù)多次。

3. 用上述細(xì)胞裂解液回收。

樣品制備完，應(yīng)立即低溫保存（-20度短期（幾天）；-80度長(zhǎng)期；例外，IP用樣品應(yīng)直接進(jìn)行IP，避免凍融破壞蛋白質(zhì)間弱的相互作用）。SDS LB煮沸過(guò)的樣品凍融會(huì)存在另一個(gè)問(wèn)題，SDS沉淀；SDS 4度就會(huì)沉淀，何況-80度。上樣前應(yīng)加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（SDS LB不夠，樣品未充分溶解也會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似拖尾；上樣過(guò)大也會(huì)）。

 

在樣品制備過(guò)程中，另一個(gè)需要注意的問(wèn)題是，從樣品制備的起始階段就要注意定量問(wèn)題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太細(xì)微的差別經(jīng)常忽略不計(jì)。細(xì)胞樣品可以先計(jì)數(shù)再接種，短時(shí)間內(nèi)即使細(xì)胞生長(zhǎng)有差異也不會(huì)對(duì)WB結(jié)果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織的大?。ǚQ(chēng)重）開(kāi)始，裂解液的體積都是精確定量的，操作過(guò)程也盡量避免蛋白損失。

 

蛋白電泳：

電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請(qǐng)參考分子克隆。經(jīng)驗(yàn)之談，8%膠最底邊約36KDa，10%最底邊約25KDa，12%最底部約12KDa。8%膠可以跑300KDa-36KDa之間的任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的的影響都問(wèn)題不大。12%，180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的影響都問(wèn)題不大（300KDa蛋白如何，沒(méi)有嘗試過(guò)）。

電泳一般采用恒流，45mA-55mA（應(yīng)根據(jù)電泳儀器適當(dāng)調(diào)整，要注意儀器最高限壓；此條件適合gibco model V16型，膠寬20cm）。采用恒流的優(yōu)點(diǎn)，保證最快速度完成電泳（電壓會(huì)逐漸增大），省時(shí)且減少擴(kuò)散；但是由于電泳速度過(guò)快時(shí)會(huì)發(fā)熱而溶膠，所以你必須想辦法散熱。散熱不好，條帶出現(xiàn)波浪狀。

 

注意事項(xiàng)：

1．聚丙烯酰胺的30%母液會(huì)降解，要4度避光保存。

2．APS會(huì)失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個(gè)月左右。-20度分裝長(zhǎng)期保存。

3．注意Tris buff的PH值，以及平時(shí)所用的水的PH值。PH值改變會(huì)使帶型非常怪異，所有蛋白和溴酚藍(lán)壓成一條細(xì)線(xiàn)（即便在分離膠中），如果溴酚藍(lán)前有紅色染料，那么此染料彗星式拖尾從溴酚藍(lán)一直延伸到膠底部（溴酚藍(lán)此時(shí)涌動(dòng)極緩慢，位于膠中上部）

4．上下層式電泳裝置若漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內(nèi)外式電泳裝置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會(huì)過(guò)熱。SDS-PAGE膠可能局部自溶，條帶扭曲、變形。

5．配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時(shí)洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看似平滑，但是一些細(xì)微的凹陷處會(huì)凝結(jié)肉眼無(wú)法分辨的膠顆粒（摸上去疙疙瘩瘩），其壞處是，在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過(guò)該處或電泳散熱不好，條帶變形。如果是RNA的超薄膠，膠板的顆粒會(huì)導(dǎo)致局部巨大氣泡，非常難于清除；蛋白膠也會(huì)導(dǎo)致一些小氣泡的產(chǎn)生。玻板沒(méi)洗凈的另一個(gè)壞處是，由中學(xué)物理知識(shí)可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗凈的玻板會(huì)削弱和膠體間的粘附力，拔梳子或邊條時(shí)會(huì)產(chǎn)生微小的錯(cuò)動(dòng)，膠體下部出現(xiàn)大量氣泡（夾在玻板和膠之間，這個(gè)關(guān)系不大）；嚴(yán)重的錯(cuò)動(dòng)會(huì)使上樣時(shí)，樣品從膠和玻璃之間的間隙漏光，或者甚至膠和玻板分開(kāi)。為避免拔梳子時(shí)的錯(cuò)動(dòng)，可在電泳緩沖液中拔梳子（比水更好，有SDS潤(rùn)滑）。

6．上樣時(shí)，不要把槍頭深入膠孔過(guò)深（或者采用細(xì)的尖端拉長(zhǎng)的專(zhuān)用上樣槍頭），可能會(huì)錯(cuò)開(kāi)膠和玻板，樣品會(huì)泄露。

7．未加樣的孔應(yīng)添加高濃度SDS LB平衡，否則最外側(cè)條帶會(huì)拉寬變形。通常20μl樣品（含4μl 5×SDS LB），可用8μl 5×SDS LB平衡。同理，點(diǎn)marker的lane也要加入同樣體積的LB。LB若在室溫放置太久和新鮮的在比重上會(huì)有差異，在新舊LB靠近的地方，條帶會(huì)拉寬或擠壓變形。因此，同一塊膠上，煮樣及填空白所用LB應(yīng)一致。LB應(yīng)-20度保存。

8．增加上樣量不一定會(huì)提高熒光信號(hào)強(qiáng)度。增加上樣量的后果通常只能是讓你的內(nèi)參粘連，所有的蛋白條帶都扭曲變形。因?yàn)樵黾由蠘恿孔疃嘀荒芴岣邘妆?，?span>WB靈敏度是以10的幾次冪量級(jí)的，所有目的蛋白信號(hào)的唯一方案就是IP富集（可特異提高目的蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾）。增加上樣量的另一個(gè)壞處是，本來(lái)高表達(dá)的蛋白，諸如內(nèi)參，在同樣WB條件下，可能出現(xiàn)熒光灼燒式粹滅（一晃而滅）或者條帶中空。

仍以6孔板80%以上匯合度為例，細(xì)胞裂解液和SDS LB通常都是投入200μl（最少80μl，這樣面積的培養(yǎng)板如果裂解液投入太少，回收時(shí)的損失就太大，上樣就很難做到一致），而這種濃度條件下制備的樣品，電泳時(shí)上樣量要控制在5-6μl，最少2.5μl，最多10μl，10μl時(shí)內(nèi)參基本已經(jīng)開(kāi)始粘連成一條線(xiàn)，帶型出現(xiàn)波浪紋；當(dāng)然并非不可以多上樣，再多對(duì)WB結(jié)果影響不大（沒(méi)有的仍然沒(méi)有），且條帶都很丑。

9. 不同樣品上樣時(shí)，可考慮將樣品體積調(diào)成一致或類(lèi)似。如果一組IP樣品和一組細(xì)胞裂解液樣品，前者通常洗脫體積為15μl，剛好+4μl 5×SDS LB達(dá)到常規(guī)20μl上樣體積；后者第8點(diǎn)提到只上4μl，同樣+4μl SDS LB（比重同，不會(huì)互相擠壓），最好補(bǔ)加10μl DDW使總體積一致。通常這樣不同條件獲得的樣品，中間最好用“空白”泳道隔開(kāi)（空白僅指無(wú)蛋白，仍應(yīng)加入8μl 5×SDS LB），這樣才能確保每條帶都很美觀。

 

10. SDS PAGE膠配好暫時(shí)不用時(shí)，需用電泳緩沖液灌滿(mǎn)空間（拔去梳子和底邊邊條后的間隙），用保鮮膜包裹防止液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長(zhǎng)期4度保存。

 

轉(zhuǎn)膜

很多時(shí)候新手會(huì)把WB結(jié)果無(wú)信號(hào)歸咎于轉(zhuǎn)膜不夠充分，實(shí)際上轉(zhuǎn)膜效率對(duì)最終結(jié)果的影響所占比重并不高，真正取決定性因素的是抗體識(shí)別能力的強(qiáng)弱，以及如何正確使用抗體，。

有一個(gè)簡(jiǎn)單的例證，Biorad提供的3mm厚濾紙初次使用時(shí)，通常轉(zhuǎn)膜效果不理想（從預(yù)染的marker深淺可知），但對(duì)多數(shù)一般豐度的蛋白的檢測(cè)沒(méi)有任何影響（建議少用這種新濾紙做那種含量特別稀少或者轉(zhuǎn)膜非常困難的蛋白）。沒(méi)有很好的策略可以解決這個(gè)新濾紙的問(wèn)題；嘗試過(guò)浸泡（會(huì)泡爛的）、預(yù)電泳（會(huì)稍微好點(diǎn)）等等，效果均不理想。通常，最初一兩次的使用就是用于轉(zhuǎn)一般蛋白。每次用完后清水稍微沖洗一下表面鹽分（要控制水流；水流太大，紙張會(huì)爛掉的），晾干再用；只要沒(méi)沖爛可以一直反復(fù)使用。

其次，盡管轉(zhuǎn)膜效率不起決定性作用，但由于WB的流程相對(duì)較長(zhǎng)，所以每個(gè)步驟的疊加作用會(huì)被級(jí)數(shù)放大，因此在試驗(yàn)的每個(gè)步驟我們?nèi)詴?huì)力求更好。

 

轉(zhuǎn)膜方法有半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)，這兩種轉(zhuǎn)印方法各有優(yōu)劣。濕轉(zhuǎn)適合所有的蛋白，轉(zhuǎn)膜效率最佳，但靡費(fèi)試劑、溶液，對(duì)普通分子量大小的蛋白轉(zhuǎn)染操作時(shí)間長(zhǎng)于半干轉(zhuǎn)（下文會(huì)具體給出條件）；半干轉(zhuǎn)適合分子量較小的蛋白，省時(shí)、省試劑。蛋白分子大小如何界定呢？習(xí)慣上認(rèn)為150KDa以上為大蛋白，其他均屬于小蛋白，當(dāng)然這只是一個(gè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。因此，通常對(duì)大蛋白的轉(zhuǎn)印多數(shù)人會(huì)選擇長(zhǎng)時(shí)程的濕轉(zhuǎn)，而且用半干轉(zhuǎn)做大蛋白轉(zhuǎn)印本來(lái)就是高手在懸崖上跳舞，此時(shí)轉(zhuǎn)膜效率是否更高已經(jīng)沒(méi)有任何意義——我說(shuō)過(guò)轉(zhuǎn)印效率對(duì)WB結(jié)果不起決定因素。

濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)緩沖液配方請(qǐng)參考分子克隆，有必要指出的是，實(shí)際上用半干轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行濕轉(zhuǎn)效果也非常理想，通常這種緩沖液可以反復(fù)使用多次（≤5次常規(guī)1hr電轉(zhuǎn)，如有3hrs長(zhǎng)時(shí)程轉(zhuǎn)染，緩沖液使用次數(shù)會(huì)減少），不過(guò)要注意初始電流（同樣溫度下，初始電流高，表明緩沖液中電解質(zhì)剩余不多，為確保轉(zhuǎn)膜溫度，可開(kāi)始或中途更換新鮮轉(zhuǎn)膜液）。電轉(zhuǎn)液中SDS增加蛋白的水溶性，促進(jìn)蛋白在電轉(zhuǎn)液中泳動(dòng)。若不加SDS，蛋白會(huì)沉淀在膠上，但SDS過(guò)多會(huì)影響蛋白與膜的吸附。甲醇能使SDS與蛋白分離，甲醇濃度越高SDS與蛋白分離越快，但高濃度的甲醇對(duì)蛋白會(huì)有固定作用，不利于蛋白從膠里跑出來(lái)。一般來(lái)說(shuō)甲醇的濃度為20%，但PVDF膜截留marker上交聯(lián)的小分子顏料的能力很差，可考慮提升甲醇的濃度至25%（它對(duì)普通蛋白的轉(zhuǎn)膜影響不太，顏料截留更多）；大蛋白轉(zhuǎn)印可考慮降低甲醇濃度，另外SDS必須添加。甲醇的另一個(gè)作用是降溫，舊的電轉(zhuǎn)液由于電解質(zhì)的消耗和甲醇的揮發(fā)，電轉(zhuǎn)時(shí)電流或電壓變化更快、溫度升高也更快，因此可考慮增加額外的甲醇；這點(diǎn)對(duì)半干轉(zhuǎn)緩沖液的意義較大，因?yàn)榘敫赊D(zhuǎn)緩沖液消耗很慢，緩沖液放置的時(shí)間較久，甲醇揮發(fā)比較嚴(yán)重，可臨時(shí)少量補(bǔ)加。

 

濕轉(zhuǎn)一般采用穩(wěn)壓，電壓控制在120-140V，時(shí)長(zhǎng)1-3h（小蛋白控制在1h，大蛋白3h）；半干轉(zhuǎn)一般穩(wěn)流，依millipore PVDF膜附帶說(shuō)明書(shū)，當(dāng)2.5-3mA/cm2，電壓25V（biorad半干儀額定值不能超過(guò)25V；amersham半干轉(zhuǎn)儀，限壓30V。通常跑不到這么大的電壓，除非是新的濾紙或很久的轉(zhuǎn)膜液，或常溫放置的轉(zhuǎn)膜液，或超大的膠），時(shí)間一般15--45min（常規(guī)用0.5h）；如果是3mA/cm2，時(shí)間不要超過(guò)0.5。這兩款儀器的限壓要求，可能出于保護(hù)儀器的目的；amersham為防止過(guò)載，當(dāng)電壓>30V，～35V附近的時(shí)候，保險(xiǎn)會(huì)自動(dòng)跳掉、切斷電轉(zhuǎn)儀電源。至于UK的，即使整張大板膠室溫電轉(zhuǎn)3h以后，最大電壓仍為18V（因此足見(jiàn)其散熱性能的優(yōu)良）。注明：以上半干轉(zhuǎn)儀時(shí)間的要求是針對(duì)PVDF膜的，這里面有一個(gè)很有趣的問(wèn)題。盡管廠家一再表明PVDF膜比NC膜對(duì)蛋白的截留更高（但NC帶負(fù)電性，理論上它的吸附量應(yīng)該更高，所以通常同樣使用TBST這種低鹽洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜對(duì)小分子的截留明顯不如NC膜，因此交聯(lián)在預(yù)染marker上的顏料小分子很容易穿過(guò)PVDF膜，造成轉(zhuǎn)膜過(guò)度的假象（除可考慮提升甲醇濃度至25%外，也可以考慮增加marker的上樣量）；NC膜沒(méi)有這種問(wèn)題，所以通常它的轉(zhuǎn)膜時(shí)間也是小蛋白1h、大蛋白3h，電流控制在200-300mA（16cm×9cm大膠300mA，如果膠面積小很多可以考慮降低，實(shí)際上相當(dāng)于2.5-3mA/cm2左右）。NC膜唯一不如PVDF膜的地方，在我看來(lái)是它的強(qiáng)度：干燥的膜易碎。當(dāng)然目前某些廠家為解決這個(gè)問(wèn)題，將NC成分涂在另一種介質(zhì)的表面，這種膜的支持強(qiáng)度和PVDF膜類(lèi)似，但轉(zhuǎn)膜效率稍差于純NC膜，且有明顯的正反面；因此制作轉(zhuǎn)印三明治的時(shí)候要特別注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22μM孔徑的轉(zhuǎn)印膜，但也不是一定必須。

 

對(duì)于大蛋白轉(zhuǎn)印，很多書(shū)本建議采用低濃度膠，如6% SDS-PAGE。但實(shí)際操作發(fā)現(xiàn)，6%太軟，制作轉(zhuǎn)印三明治的操作非常麻煩；且內(nèi)參如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%膠底邊溴酚藍(lán)指示60KDa左右，除非采用壇子上有人提過(guò)的灌不同濃度的膠或者梯度膠，否則需要同時(shí)跑兩塊膠，因此也不是很推薦。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為300KDa以下8%膠（底邊36KDa）都可以勝任，可以適當(dāng)調(diào)整選擇7-8%膠可以兼顧內(nèi)參和大蛋白。

 

轉(zhuǎn)膜最好在低溫進(jìn)行（高溫會(huì)局部溶膠或降低轉(zhuǎn)膜效率），盡管很多半干轉(zhuǎn)儀沒(méi)有具體要求，但用預(yù)冷過(guò)的電轉(zhuǎn)液濕濾紙比未預(yù)冷的轉(zhuǎn)印效率更高。因此，有條件建議濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)均在低溫（4度）進(jìn)行。此外，濕轉(zhuǎn)緩沖液可以考慮轉(zhuǎn)印前-20度預(yù)冷，時(shí)間不能長(zhǎng)于2h，否則電泳液凍結(jié)。

制作轉(zhuǎn)膜三明治的過(guò)程中，書(shū)中強(qiáng)調(diào)過(guò)濾紙、膠、膜的大小最好一致，否則沒(méi)有膠、膜隔開(kāi)部分的濾紙會(huì)因?yàn)橹苯咏佑|而產(chǎn)生局部短路，降低內(nèi)阻增加電（壓）流，造成升溫過(guò)快。但進(jìn)口儀器隨廠原包裝附帶的濾紙有限，如果每次都切割新濾紙，消耗過(guò)快、初次使用的膜轉(zhuǎn)膜效率不高，且增加額外的操作。因此，實(shí)際上濾紙大一些也不太要緊，通常膜的大小會(huì)嚴(yán)格控制在與膠面積一致或略小一點(diǎn)點(diǎn)。操作時(shí)在保證每一層均無(wú)氣泡的前提下，疊好后再碾壓幾個(gè)來(lái)回，力道要均勻、恰好；力量過(guò)大，膠會(huì)被拉伸，條帶會(huì)扭曲、變形。碾壓的目的不是為了驅(qū)趕氣泡（完全可以做到疊加的時(shí)候每一層都無(wú)任何氣泡；諸如采用多層薄濾紙時(shí)可以一張張的疊加），更重要的作用是讓膜和膠貼得更緊密?？梢岳斫獾氖牵瑢?duì)于蛋白分子的大小而言，膠和膜之間的間距是數(shù)十萬(wàn)倍計(jì)的，因此更緊密的接觸無(wú)疑是轉(zhuǎn)膜成敗的關(guān)鍵。

 

膠和膜需不需要泡呢？不少公司實(shí)驗(yàn)講座時(shí)提出泡膠、泡膜，實(shí)際操作中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)泡和不泡的轉(zhuǎn)膜效率有多大差別。實(shí)際上，膠只需要在電轉(zhuǎn)液中浸一下即可（可以減少與濾紙或者膜之間的氣泡）；而膜也只要濕掉沾上電轉(zhuǎn)液即可，同樣多沾些緩沖液會(huì)有利于減少氣泡（PVDF要先用甲醇濕潤(rùn)再投入緩沖液；NC直接進(jìn)緩沖液）。

 

抗體孵育

——WB真正的難點(diǎn)：抗體的使用是一種藝術(shù)，一種抗體一個(gè)脾氣。

對(duì)WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價(jià)和如果正確使用手中的抗體。無(wú)論你如何提高自己的轉(zhuǎn)膜技術(shù)，高效和低效之間往往只有數(shù)倍的差異，而抗體的效價(jià)可以差數(shù)千倍以上；同樣，正確使用抗體可以保證抗體效價(jià)不被過(guò)分的拮抗，謀求特異性和非特異性背景之間差異的最大化。

 

封閉最短可以縮減到5min：

很多人把高背景或者黑板，認(rèn)定為封閉不充分，其實(shí)這也是沒(méi)有吃透WB（說(shuō)實(shí)話(huà)，經(jīng)?？吹綁由虾芏嗳诉@樣給人答疑，非常的無(wú)語(yǔ)）；實(shí)際上封閉（極端點(diǎn)）也是個(gè)可有可無(wú)的步驟，真正對(duì)降低背景起核心作用的是抗體稀釋液中的組分。當(dāng)你的抗體使用次數(shù)較多時(shí)，基本不用封閉也可以有較低的背景；如果抗體很新，其實(shí)封閉最短可以縮減到5min（沒(méi)試過(guò)更短的，不一定不可以）。那什么導(dǎo)致高背景甚至黑板呢？抗體的質(zhì)量不太好（主因），或者抗體稀釋液的配方有問(wèn)題（增大抗體稀釋比略微有所改善）。封閉液的配方可以和抗體稀釋液相同，也可以不同；通常封閉液是最簡(jiǎn)單（單方）的抗體稀釋液，而抗體稀釋液可能是復(fù)方。

封閉很少出狀況。不過(guò)在脫脂奶做封閉劑的封閉液中，脫脂奶顆粒未完全溶解時(shí)，微小的顆粒會(huì)粘附在膜上增加星點(diǎn)狀背景。

 

緊接封閉操作的是抗體孵育，之間不要用TBST漂洗?？贵w孵育成敗的關(guān)鍵首要在抗體本身的質(zhì)量，包括抗體的效價(jià)和背景的強(qiáng)弱，然而歷來(lái)商品化的抗體質(zhì)量參差不齊。抗體公司在出售抗體的時(shí)候，在廣告上會(huì)玩很多花樣。A.不給整張膜標(biāo)記的圖示。很多抗體質(zhì)量不好，背景高雜帶多，如果靶蛋白區(qū)域較干凈時(shí)，他們通常只給很窄的一條靶蛋白區(qū)域的圖例。B.不給內(nèi)源性蛋白標(biāo)記的圖示，用IP的樣品取代。通過(guò)IP可以富集抗原，減少雜蛋白，通常很容易拿到背景很干凈，信號(hào)很強(qiáng)的圖例。C.用制備抗體時(shí)高表達(dá)的多肽做陽(yáng)性樣品，不給全長(zhǎng)蛋白的圖例。由于多肽可以IP富集，且不存在空間折疊的問(wèn)題（通常裸露在外），因此很容易標(biāo)記。除以上花樣外，不少抗體用途上還有局限，因此挑選抗體時(shí)要睜大眼睛。

一抗通常4度過(guò)夜，效率較常溫1-1.5h高；二抗通常1:5000稀釋?zhuān)覝?span>0.5-1h（過(guò)久并不會(huì)明顯提高信號(hào)強(qiáng)度甚至?xí)p弱（相當(dāng)于洗膜），同時(shí)造成高背景進(jìn)一步影響特異與非特異熒光信號(hào)強(qiáng)度間的對(duì)比。孵育時(shí)間過(guò)久還會(huì)迫使你延長(zhǎng)TBST的時(shí)間，這對(duì)抗原識(shí)別能力較弱的抗體更致命）。洗膜通常用TBST，也可以考慮高鹽洗膜液（NaCl 0.5M）；洗膜時(shí)間一般3×10min或者4×5min?？贵w孵育和洗膜時(shí)，搖床速度不能過(guò)快也不宜過(guò)慢，需要簡(jiǎn)單摸索一下。

 

如何通過(guò)改變抗體稀釋液的配方，尋求抗體孵育的最佳條件呢？

首先要認(rèn)清，抗體稀釋液沒(méi)有一個(gè)絕對(duì)通用的配方；一種抗體一個(gè)脾氣。

其次，抗體稀釋液的配方要兼顧與特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)抗原的強(qiáng)度，以及對(duì)其他區(qū)域的封閉強(qiáng)度兩方面的平衡。

目前，抗體稀釋液中可以充當(dāng)封閉蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的樣子。。?？墒?，你有沒(méi)有考慮過(guò)“復(fù)方”？——這下配方無(wú)限多了吧。

1. 采用milk，BSA和gelatin的單方。3% milk，5% BSA，<=0.4%的gelatin，并根據(jù)實(shí)際情況改變（若出現(xiàn)白板，請(qǐng)降低封閉劑濃度。；黑板多加）。gelatin大家可能比較陌生，不過(guò)如果你翻翻抗體公司賣(mài)給你的原裝抗體里面液體的配方，你會(huì)發(fā)現(xiàn)很多抗體溶液里都有它。

2.很多情況下單方的濃度很高了，背景問(wèn)題仍不能解決。那么請(qǐng)嘗試兩兩或者三種不同比例混合。不過(guò)有些細(xì)節(jié)還是要自己摸索的，比如gelatin＋BSA時(shí)，gelatin濃度不能無(wú)限提高（會(huì)完全競(jìng)爭(zhēng)掉抗原抗體特異性結(jié)合，導(dǎo)致白板），BSA的濃度較隨意。

3.抗體稀釋液可用低鹽濃度的TBST，也可用高鹽濃度的緩沖液（NaCl 0.5M）以降低背景；但是切記，有的抗體對(duì)鹽濃度敏感，包括構(gòu)象和溶解度，因此需要嘗試。

如果以上策略仍然無(wú)法解決高背景，可將稀釋好的一抗先跟平時(shí)實(shí)驗(yàn)剪切下來(lái)的membrane的邊角料（新的）放在一起孵育個(gè)把小時(shí)再用。如果還不行，徹底無(wú)解，結(jié)論抗體太差；請(qǐng)更換別的公司或者抗別的區(qū)段的同種抗體。

 

這三種封閉蛋白的差異：

milk和gelatin封閉效果不錯(cuò)且價(jià)格便宜，但milk容易發(fā)霉變質(zhì)，且國(guó)產(chǎn)milk脫脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗體結(jié)合（拮抗與抗原結(jié)合尤其突出；更不知道三聚氰胺會(huì)不會(huì)影響抗原抗體結(jié)合或者ECL?。浚?；BSA封閉效果不佳，且價(jià)格較昂貴。個(gè)人推薦gelatin，gelatin主要成分是骨膠原，蛋白很大，但可以通過(guò)加熱打斷成小蛋白，從而實(shí)現(xiàn)封閉各種分子量大小的蛋白。通常，我會(huì)將gelatin加到TBST中后直接滅菌，滅菌過(guò)程中，不溶的gelatin會(huì)逐漸溶解；由于gelatin可以滅菌（milk不可以），所以同樣條件下，gelatin的存放時(shí)間明顯長(zhǎng)于milk。實(shí)際上，抗體可以反復(fù)用很久（通常一般的抗體常規(guī)稀釋比，可以連續(xù)用一個(gè)月以上；對(duì)于老手用過(guò)2、3次的舊抗體更prefer，因此背景降到很低而效價(jià)正是最高的時(shí)候），通?？贵w最后失效的原因不是因?yàn)槭褂么螖?shù)過(guò)多，而是染菌；比較舊的抗體都會(huì)有很多的沉淀在底部，更長(zhǎng)時(shí)間還會(huì)有異味。稀釋的一抗靠添加NaN3并于4度保存延長(zhǎng)使用時(shí)間；二抗不能加NaN3，但放在-20度反復(fù)凍融延長(zhǎng)使用壽命（抗體并非絕對(duì)不可以?xún)鋈?；只是高濃度的原始管抗體的凍融對(duì)效價(jià)會(huì)有較大影響）。

抗體稀釋液（一抗、二抗稀釋液也可同也可不同）和封閉液可以相同，可以不同，因?yàn)榭贵w稀釋液可以采用復(fù)方的，所以即使混合了少許，不會(huì)對(duì)抗體的使用產(chǎn)生較大的影響。不過(guò)封閉液用milk時(shí)，gelatin稀釋的一抗混入少許milk會(huì)影響其使用壽命。

由于以上諸多可變因素，實(shí)在無(wú)法總結(jié)出一種萬(wàn)金油式的抗體稀釋液（只能是多數(shù)通用），因此對(duì)待具體問(wèn)題時(shí)，請(qǐng)具體對(duì)待（多花點(diǎn)心思摸索吧）。

 

原裝抗體的保存：

1. 分裝。每次一管，但是可能太多占地方，而且還會(huì)有粘壁的損失，不是很推薦。

2. 1：1加甘油，凍于-20度，可長(zhǎng)期保存，此方法實(shí)際上也被很多國(guó)內(nèi)的試劑公司廣泛采用，諸如博士得，中杉，它們小包裝的進(jìn)口抗體通常都是1：1添加甘油保存于-20（不信去查查）。值得注意的是：不是所有的抗體都可以1：1添加甘油，要以抗體說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)，如果說(shuō)明書(shū)中本身存在甘油，或特殊注明外，通?？梢圆捎谩?span>

 

顯影

——淬滅的禍因

 

當(dāng)抗體孵育、TBST漂洗結(jié)束后，進(jìn)入ECL顯影步驟。當(dāng)然，目前國(guó)內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)換用儀器掃描熒光信號(hào)，而我們更是二抗直接連熒光蛋白連ECL和常規(guī)的底片顯影都省略了，因此以下所討論的某些細(xì)節(jié)問(wèn)題可能不再出現(xiàn)。

首先壇子上還有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室處于DAB顯色時(shí)代，奉勸一句，都走到最后一步了就不要節(jié)省了；DAB顯色的靈敏性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前較為流行的仍是化學(xué)發(fā)光法，下面簡(jiǎn)述一下其原理：

交聯(lián)在二抗上的HRP酶能夠特異水解過(guò)氧化物產(chǎn)生化學(xué)能；ECL中主要包含兩種成分，催化劑和中間遞質(zhì)（白色瓶子主要是過(guò)氧化物如雙氧水）。催化劑的作用不用廢話(huà)了，其中間遞質(zhì)主要是吸收化學(xué)能并將其傳遞到luminol之類(lèi)的化合物上產(chǎn)生電子躍遷從而激發(fā)熒光。因此催化劑的效率和中間遞質(zhì)的傳遞效率直接影響熒光的強(qiáng)弱。本人曾自制過(guò)ECL并嘗試改良，其間發(fā)現(xiàn)很多化合物、金屬離子如Fe、Cu等能催化并高效傳遞能量，且不依賴(lài)于HRP濃度，熒光信號(hào)能瞬間曝強(qiáng)；這其實(shí)與下文提到的一些粹滅原因有聯(lián)系。

 

當(dāng)初我自制的ECL最大的毛病在于穩(wěn)定性不好，同理，商品化的ECL同樣也有保質(zhì)期的問(wèn)題，往往最先失效的組分就是過(guò)氧化物，盡管他們必然添加過(guò)抗還原劑。其實(shí)，檢驗(yàn)ECL是否失效的方法很簡(jiǎn)單，取稀釋的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中觀察熒光強(qiáng)度，即可知道ECL是否失效。

商品化的ECL價(jià)格并不便宜，因此ECL孵育的最佳方案是：將ECL滴加在保鮮膜上或干凈的支持物上，如廢棄的舊底片、塑料盒，有機(jī)玻璃盒等等（注意，國(guó)產(chǎn)的保鮮膜很多質(zhì)量不過(guò)關(guān)，有兩種潛在的問(wèn)題，下面詳述），然后倒扣膜于保鮮膜上，夾住一個(gè)角來(lái)回拖動(dòng)數(shù)次至ECL均勻（有的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求孵育1min）。另外平鋪一張干凈的保鮮膜，將膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后顯影。mini3型膠整張膜孵育，ECL總體積0.7-1ml足矣。

 

哪些因素會(huì)影響熒光信號(hào)的強(qiáng)弱呢？（這部分實(shí)際上與導(dǎo)致熒光淬滅的因素部分重合）

1.保鮮膜的質(zhì)量。a.國(guó)產(chǎn)的保鮮膜，很多廠家偷工減料打價(jià)格戰(zhàn)，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔泄露，一方面ECL反應(yīng)不充分，另一方面ECL所含液體會(huì)溶解試驗(yàn)臺(tái)上殘留未知的化學(xué)藥品顆粒（也許你或其他人曾經(jīng)不小心打翻過(guò)某種化合物）、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡(jiǎn)述原理時(shí)，我曾經(jīng)提到過(guò)很多化合物、金屬離子能直接催化過(guò)氧化物水解，在極短的時(shí)間內(nèi)消耗掉所有的HRP酶，熒光轉(zhuǎn)瞬即逝。

b. 保鮮膜的化工原料或拉制過(guò)程中，殘留未知的化學(xué)試劑，引起熒光淬滅；廉價(jià)的保鮮膜問(wèn)題尤多。

目前，國(guó)產(chǎn)的就“妙潔”比較過(guò)關(guān)，保鮮膜厚度和化學(xué)物殘留都不影響ECL顯影。

如果買(mǎi)不到合格的保鮮膜，也可以用其他物品替代；但要特別注意這些支持物表面的干凈，最好不要有任何化學(xué)試劑殘留，包括風(fēng)干的TBST鹽結(jié)晶顆粒。

2.ECL孵育結(jié)束后膜需要控干。中學(xué)物理學(xué)過(guò)水會(huì)吸收光譜，因此任何液體包括ECL溶液本身都會(huì)干擾熒光強(qiáng)度，所以ECL孵育結(jié)束時(shí)需要控干。一般夾起膜，讓膜的一角或一邊接觸吸水紙；但是請(qǐng)注意不能讓膜完全干掉。某些信號(hào)較弱的ECL，膜徹底干掉后熒光會(huì)消失；較好的試劑盒，熒光相對(duì)穩(wěn)定，但完全吸干以后，背景熒光也會(huì)升高，而且會(huì)嚴(yán)重影響重新標(biāo)記新抗體時(shí)的背景。因此，按照我的方法，讓自由流下的多余的ECL被吸走就好。

3.控干的膜要仔細(xì)用保鮮膜包被，防止接觸外界異物造成熒光淬滅；同時(shí)，包裹保鮮膜時(shí)要細(xì)心，盡量不讓正面保鮮膜和膜之間出現(xiàn)皺褶。皺褶的地方會(huì)堆積多余的ECL，要么形成一條熒光的亮線(xiàn)；要么由于液體吸收熒光或者局部區(qū)域HRP過(guò)度消耗，呈線(xiàn)條狀淬滅。

4.在膜放入壓片夾之前，最好肉眼觀察一下熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，這有利于判斷實(shí)驗(yàn)可能出現(xiàn)的問(wèn)題。很多人提問(wèn)看見(jiàn)很強(qiáng)的熒光了，但怎么壓片都沒(méi)有信號(hào)，那么就是快速淬滅（閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種情況下的熒光信號(hào)）造成的；有這個(gè)觀察至少能夠判斷ECL孵育之前實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)該問(wèn)題不大，而問(wèn)題主要是淬滅。如果你省略這個(gè)步驟，那問(wèn)題就非常復(fù)雜了，因?yàn)橹叭魏尾僮鞫伎赡軐?dǎo)致白板，根本無(wú)法判斷。

 

除上述的問(wèn)題以外，還有哪些因素會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅呢？

1. 抗原濃度太高，熒光信號(hào)過(guò)強(qiáng)，快速淬滅。在電泳的章節(jié)就曾提過(guò)，如果上樣量太大，不僅條帶會(huì)粘連、彎曲，更可能導(dǎo)致淬滅。因?yàn)榫植繀^(qū)域過(guò)多的HRP酶會(huì)快速消耗底物呈富氧態(tài)，條帶出現(xiàn)燒灼樣（取出膜會(huì)發(fā)現(xiàn)一條明顯的暗黃色的帶），熒光信號(hào)會(huì)閃滅或者條帶空心（條帶灰黑不實(shí)，則可能是顯影液接近失效）。

2. 抗原濃度太低，熒光信號(hào)太弱，相對(duì)慢一點(diǎn)的淬滅。可能第一次壓片能夠獲得很弱的條帶，隨后都不可見(jiàn)。

3. ECL試劑質(zhì)量。除過(guò)氧化物因接觸空氣被逐漸還原外，ECL的成分通常都不穩(wěn)定。如呈遞電子躍遷能的中間遞質(zhì)其化學(xué)性質(zhì)就不太穩(wěn)定，因?yàn)樗D(zhuǎn)換能量的特性決定其必是一個(gè)有中間態(tài)的化合物，長(zhǎng)期接觸空氣會(huì)被逐漸氧化失效；luminol也有保質(zhì)期。

4. 操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，膜逐漸徹底干掉。商品化的ECL會(huì)出現(xiàn)波形漸變，開(kāi)始信號(hào)逐漸增強(qiáng)，背景一起升高；隨后熒光完全衰減淬滅。